小型猪坏死性结肠炎模型
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小型猪坏死性结肠炎模型

时间:2021-03-16    访问量:5

  坏死性结肠炎(necrotising enterocolitis,NEC)是最常见的威胁新生儿生命的胃肠道急性病,使得5%的新生儿住进了重症监护室,并导致20%~40%的死亡率。NEC的发病机制并不清楚,目前公认的主要致病因素包括:肠道发育不成熟、肠道营养吸收不良、细菌定植紊乱,还有研究者认为肠道的血流动力学和血管变化也可能是原因之一。最令人困扰的是到目前为止NEC没有特异性的治疗方法,尽管新生儿重症监护和生存环境整体上都得到改善,但是前面提到的数据并没有下降。NEC还常伴发于长期肠外营养、多种类型的手术以及短肠综台征。这些数据让人惊讶,引起了患者、医者与研究者的广泛重视。

  1.研究模型实例一:缺氧和(或)内毒素诱导的NEC

  (1)实验设汁:动物被分为4组,分别记录三次时间长度为45分钟的自由呼吸数据,三组数据平稳之后再开始实验。第一组(对强组):自发完全自主呼吸房间空气,在实验开始时通过中心静脉推注1ml/kg猪血清白蛋白。第二组(缺氧组):从实验开始时动物呼吸房间空气45分钟,然后呼吸45分钟含10%氧气的空气,之后继续呼吸45分钟房间空气。第三组(内毒素组):自发完全自主呼吸房间空气,在实验一开始时股静脉推注2ml/kg脂多糖。第

  四组(缺氧/内毒素组):按照第二组的步骤造成缺氧,同时在实验开始时,按照第三组的步骤给予脂多糖。

  (2)手术方法:27头足月的新生堪培拉白猪,平均年龄足3日龄(2~6日龄),平均体重是1997g(1465~2270g),在实验开始之前的2~3小时从窝里取出。氧气中混合3%~5%的异氟烷按照3.5L/min的速度输入一个麻醉盒,再通给面罩。诱导麻醉之后,气管插管给予含2.5%异氟烷的氧气维持麻醉,然后颈静脉插入导管,中断吸入麻醉,静脉给予安泰酮(Saffan),用生理盐水稀释,最初按4~8mg/kg剂量给予,在手术期间按4mg/kg推注,之后以同样浓度按16~24mg/(kg·h)持续静脉输注,手术结束后实验期间按7~12mg/(kg·h)静脉输注。安泰酮的作用时间短,只有持续给药才能有效地止痛,它对心血管系统和呼吸系统的影响微弱。一旦麻醉开始,监测肛温,使用加热垫和加热灯使其维持体温在38.5~39.5℃。电子肺量计通过气管捅管连续记录呼吸频率和潮气量。股动脉捅管测量搏动的动脉压(arterial blood pressure,ABP),从而可推算出心率。股静脉插管后,进而插入下腔静脉,用于中央静脉给药。

  (3)腹部观察:从腹正中作切口探查腹部,小心剥离肠系膜上的一条动脉分支,将电磁流量探头放置在肠系膜动脉周围,以便持续记录肠系膜血流量(mesenteric blood flow,MBF)。短暂的夹住血管来归零流量计,尽量将肠道处理带来的伤害控制到最小,暴露的肠道用温生理盐水浸泡过的纱布覆盖。一旦监测的血流量稳定,将肠道放回腹腔并进行缝合,腹部闭合后稳定1小时。肠系膜血管电导可以通过MBF/ABP的比值进行实时计算。

  (4)生理监测结果:对照组的生理参数未见明显变化,缺氧组的血压在整个实验过程中都没有变化,内毒素组的血压在45分钟和90分钟有明显减低,但是在实验的末期又回到了基线。缺氧/内毒素组的动脉压在实验的末期有轻微的下降。

  1)肠系膜血流(MBF):缺氧组和内毒素组的MBF没有明显的变化,而在缺氧/内毒素组MBF有平稳地下降,在90分钟和135分钟时下降的尤为明显。

  2)动脉血的氧分压、二氧化碳分压和PH:对照组中都正常,在其他三个实验组都经历了缺氧,均有相似的低氧血症,在90分钟时氧分压从68mmHg降到40mmHg,在恢复呼吸之后,氧分压回到了68mmHg,在整个实验过程中各缺氧组之间未见明显差异。各个实验组的二氧化碳分压比较稳定,在任何时候都未见明显差异。各组的m液pH基础值都接近7.4,但在对照组和缺氧组的实验后期有升高的趋势。在内毒素组pH没有显著地降低,但是在缺氧/内毒素组的平均pH有所下降,在90分钟时显著低于对照组,并在实验的后期逐渐恢复。

  3)血液学分析:各个处理组的血红白蛋白没有明显变化;给予内毒素的两组白细胞(white blood cell,WBC)有显著下降,而缺血组中没有明显变化;各个处理组中血小板的降幅不大,但是在统计学上有显著差异,在实验的所有阶段均小于350×109个/L。

  4)病理分析:肉眼检查和显微检查下可以看到对照组和缺氧组无异常变化,肉眼可以看内毒素组、缺氧/内毒素组的小肠和大肠的浆膜表面有同样的灰暗变色,散在的出血性病变,长度在0.1~10cm,大多数分布在回肠和盲肠。缺氧/内毒素组比内毒素组的出血性坏死分布更广。

  缺氧组仅引起血流动力学变化,肉眼和显微镜下均未见肠组织病理学的变化,内毒素组引起轻微的低血压,MBF降低,肉眼和显微镜观察均见肠道坏死。但是,缺氧/内毒素组明显加重了血液学改变,更大范围的坏死,可见并发的代谢性酸中毒,这组的表现与新生儿发生NEC的早期病理过程非常的相似。之前报道,猪的NEC模型只能通过重大创伤法制作,如结扎或阻断肠系膜动脉、深度窒息与腔内注射酸化的络蛋白等,这些实验损伤方式都不能反映临床的情况,然而这个模型展现了NEC样的坏死,与临床病变更相似。如果想制作不同程度的NEC坏死样模型,研究显示血小板活化因子(PAF)是促使NEC发生的相关因子,所以研究者认为可以使用PAF受体拈抗剂WEB2170来改善缺血和内毒素引起的NEC症状。

  2.研究模型实例二:缺血引起NEC的改良模型  大多数的NEC动物模型都是通过造成缺血伤害而引起全部肠道坏死,这与解剖学上的NEC偏好发生于回肠远端和结肠是不一致的,可见这种建模方式并不能很好的模拟真实的情况。下面这个模型更有针对性,更好地体现了NEC的这个偏好性。

  (1)实验设计:新生约克夏猪8头,分为两组,第一组小于3日龄,第二组为2周龄。

  (2)手术方法:肌肉注射0.1mg/kg咪达唑仑麻醉,1%~2.5%氟烷与97.5%~99%氧气混合经气管输入维持麻醉。实行中线剖腹术,在不引起局部缺血的情况下,在回肠的近端结扎,距离回肓瓣40cm,用26号针头远侧透壁注射0.9%的温生理盐水冲洗。间隔10cm连续结扎,做出6个肠袢,4个在回肠,1个在盲肠,1个在结肠,用24号针头在肠袢注射0.9%无菌生理盐水或实验溶液,包含10mg/ml的牛酪蛋白和50mg/ml的葡萄糖酸钙,用丙酸将pH调至4.0。在注射时,注意避免肠袢过度膨胀,消除因缺血引起的损伤,然后关闭缝合腹腔。实验期间,所有的动物按5ml/(kg·h)静脉注射0.9%的生理盐水,使用电热毯或加热灯使体温保持在37℃左右。3小时后,肉眼观察肠段的损伤情况,并在心内注射戊巴比妥钠(65mg/ml)实行安乐死,收集相应的组织。用生理盐水清洗肠腔,福尔马林固定,冰冻切片后HE染色。显微镜观察可见区域性坏死、黏膜下层出血、炎性细胞浸润与淋巴结肿胀。这个模型中小于3日龄的猪肠损伤达到肌层,损伤分级为3.25左右,2周龄的猪肠道伤及黏膜,黏膜下层结构被破坏,少量肌肉层的损伤评分在2.43左右。由此可见,我们可以根据需要选择增加/减少酪蛋白的量,或者选择年龄偏大的猪来制备不同要求的NEC模型。这个模型也可用于清醒状态的研究。由于该动物模型具有简单性、可重复性、一致性、适用性,以及组织学观察的相似性,因此,猪NEC模型常用于药物治疗和病因学的研究。